8912240184
61
دانشگاه علوم پزشكي گلستان
مركز تحقيقات عفوني
Differentiation of Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar in children with dysentery in Taleghani Hospital of Gorgan using PCR, 2011-2013
افتراق انتامبا هيستوليتيكا از انتامبا ديسپار در نمونههاي ديسانتري كودكان بستريشده در بيمارستان طالقاني گرگان به روش PCR-RFLP طي سالها
انتامبا هيستوليتيكا (Entamoeba histolitica) آميب بيماريزا و عامل آميبيازيس رودهاي و خارج رودهاي در انسان ميباشد و دومين عامل تكياختهاي (بعد از مالاريا) مسبب مرگ در دنيا محسوب ميشود. طبق برآورد سازمان بهداشت جهاني (WHO) سالانه حدود 500 ميليون نفر در سراسر دنيا به انتامبا هيستوليتيكا مبتلا ميشوند و حدود 100 هزار نفر در اثر اين بيماري ميميرند. عفونت از طريق خوردن غذا يا آب يا دست آلوده به كيست آميب رخ مي دهد. شايعترين شكل آلودگي با آميب حاملين بدون علامت هستند كه كيست آميب را دفع مي كنند و 90 درصد موارد آلودگي بيعلائم هستند. در موارد علائمدار شايعترين تظاهر باليني ديسانتري ميباشد. بيماري در سن كودكي، كهولت و بارداري مي تواند بسيار شديد شود. افرادي كه كيست آميب را در دستگاه گوارش دارند عمدتاً هيچ تظاهر باليني ندارند.
بيماريهاي اسهالي علت عمدهي مرگ و مير در كشورهاي در حال پيشرفت مي باشد. در بنگلادش 1 در 30 بچه از اسهال و ديسانتري مي ميرند. افراد با آميبيازيس رودهاي اسهال دارند كه حدود 1 -3 هفته طول ميكشد كه بهتدريج مدفوع حاوي خون ميشود. تب در 8 تا 38 درصد بيماران وجود دارد و از دست دادن وزن شايع است (1).
تا سالهاي اخير تصور ميشد كه گونه انتامبا هيستوليتيكا حدود 10% جمعيت جهان را آلوده كرده است (2). تا اينكه در سال 1997 كميته منتخب WHO براساس يافتههاي بيوشيميايي، ايمنولوژيك و ژنتيك اعلام نمود كه اين آميب درواقع شامل دوگونه بيماريزا (انتامبا هيستوليتيكا) و غيربيماريزا (انتامبا ديسپار،(Entamoeba dispar است كه از نظر مرفولوژي كاملاً مشابه ولي از نظر بيوشيميايي و ژنتيكي متفاوتند و اولي بايد درمان شود ولي دومي نياز به درمان ندارد (3). بنابراين يكي از مهمترين مزاياي افتراق انتامبا هيستوليتيكا از انتامبا ديسپار جلوگيري از درمانهاي غير ضروري و درنتيجه كاهش هزينه اقتصادي بيمار، عوارض جانبي و مقاومت دارويي ميباشد. در حال حاضر افتراق اين دو گونه فقط در آزمايشگاههاي تحقيقاتي و با روش هايي مانند بررسي الگوي حركت ايزوآنزيمها، استفاده از آنتيياديهاي منوكلونال جهت شناسايي آنتيژنهاي اختصاصي و نيز روشهاي مولكولي مانند PCR اختصاصي، PCR-RFLP و Sequencing صورت ميگيرد (4). اطلاعات موجود نشان ميدهد كه شيوع انتامبا ديسپار احتمالاً 10 برابر انتامبا هيستوليتيكا در جهان است ولي شيوع در هر منطقه ممكنست بهطور قابل توجهي متفاوت باشد، كه اين مساله بر لزوم بررسي شيوع در نقاط مختلف جغرافيايي تاكيد ميكند (5).
از آنجا كه بيماري ديسانتري بهويژه در كودكان تدابير درماني فوري را براي حفظ جان بيمار ميطلبد اطلاع از علل شايع آن در هر جامعه، جهت انجام درمان مناسب توسط پزشكان، با انجام تحقيقات دورهاي ضروري بهنظر ميرسد. با توجه به اينكه مطالعه مشابهي تاكنون در گرگان انجام نشده است طرح حاضر با هدف افتراق انتامبا هيستوليتيكا و انتامبا ديسپار در نمونههاي ديسانتري كودكان بستري شده در بيمارستان طالقاني گرگان در بازه زماني 1390-1392 ارائه ميگردد.
-افتراق-انتامبا هيستوليتيكا - انتامبا ديسپار -ديسانتري
1300147200
30
از آنجا كه بيماري ديسانتري بهويژه در كودكان تدابير درماني فوري را براي حفظ جان بيمار ميطلبد اطلاع از علل شايع آن در هر جامعه، جهت انجام درمان مناسب توسط پزشكان، با انجام تحقيقات دورهاي ضروري بهنظر ميرسد. با توجه به اينكه مطالعه مشابهي تاكنون در گرگان انجام نشده است طرح حاضر با هدف افتراق انتامبا هيستوليتيكا و انتامبا ديسپار در نمونههاي ديسانتري كودكان بستري شده در بيمارستان طالقاني گرگان در بازه زماني 1390-1392 ارائه ميگردد.
1- تعيين فراواني نسبي انتامبا هيستوليتيكا در كودكان مبتلا به ديسانتري
2- تعيين فراواني نسبي انتامبا ديسپار در كودكان مبتلا به ديسانتري
3- تعيين نسبت فراواني انتامبا هيستوليتيكا به انتامبا ديسپار در كودكان مبتلا به ديسانتري
4- تعيين فراواني نسبي انتامبا هيستوليتيكا و انتامبا ديسپار بر حسب جنس در كودكان مبتلا به ديسانتري
5- تعيين فراواني نسبي انتامبا هيستوليتيكا و انتامبا ديسپار بر حسب سن در كودكان مبتلا به ديسانتري
6- تعيين فراواني نسبي انتامبا هيستوليتيكا و انتامبا ديسپار بر حسب علائم باليني در كودكان مبتلا به ديسانتري
ابتدا هماهنگيهاي لازم با بخش عفوني بيمارستان طالقاني جهت ثبت مشخصات موردنياز در پرسشنامه مربوط به كودكان داراي ديسانتري بستري در بيمارستان بهعمل ميآيد تا 105 نمونه ديسانتري طي دو سال در اين طرح بررسي شوند. هر نمونه ديسانتري پس از ورود به آزمايشگاه و ثبت دقيق مشخصات و شماره نمونه در دفتر مخصوص از نظر وجود عامل آميبي به دو روش مستقيم و تغليظ فرمالين اتر مورد بررسي ميكروسكوپي قرار خواهد گرفت. فقط نمونههاي ديسانتري كه در مشاهده ميكروسكوپي 5 عدد يا بيشتر گلبول قرمز و يا 5 عدد يا بيشتر گلبول سفيد داشته باشند و مربوط به كودكان زير 14 سال باشند وارد اين مطالعه خواهند شد (معيار ورود نمونهها به مطالعه). جهت بررسي بهتر و افزايش دقت كار هر نمونه نيز يك گسترش تهيه و با رنگ تريكروم رنگآميزي دائمي ميشود. آنگاه هر نمونه با بافر فسفات سالين و به كمك سانتريفوژ دوبار شستشو داده شده و رسوب مربوطه در لولههاي فالكون 15ميليليتري در جالولهاي و در فريزر 20- درجه تا زمان استخراج DNA و انجام آزمايشهاي مولكولي نگهداري خواهد شد. نمونههاي مثبت انتامبا هيستوليتيكا/ انتامبا ديسپار (مشخص شده با هر كدام از روشهاي مستقيم، فرمالين اتر و يا تريكروم) جهت تشخيص دقيق و تعيين گونه آميب بررسي مولكولي ميشوند.
در بخش مولكولي ابتدا با كمك كيت اسخراج DNAي كياژن، DNAي ژنومي نمونهها استخراج ميشود. سپس PCR اختصاصي آميب انتامبا هيستوليتيكا/ انتامبا ديسپار جهت آمپليفاي ژن 30 كيلو دالتوني به كمك جفت پرايمر زير انجام ميشود (14):
Forward primer (HF):
(5-AAG AAA TTG ATA TTA ATG AAT ATA-3)
Reverse primer (HR):
(5-ATC TTC CAA TTC CAT CAT CAT-3)
نتيجه PCR با استفاده از ژل آگارز و اتيديوم برومايد قابل رويت و بررسي خواهد شد. سپس موارد مثبت با آنزيم Hinf1 مورد هضم آنزيمي قرار ميگيرند. از آنجا كه الگوي برش اين آنزيم در دو گونه آميب متفاوت است با مشاهده نتايج روي ژل انتامبا هيستوليتيكا و انتامبا ديسپار از يكديگر افتراق داده خواهد شد.
پس از اتمام مراحل PCR جهت بررسي دقيقتر پنج نمونه از هر گونه جهت تعيين توالي فرستاده خواهد شد تا تواليهاي بهدست آمده از مطالعه حاضر با يكديگر و با ساير موارد موجود در ژنبانك مورد مقايسه قرار گيرند. در نهايت انواع تواليهاي بهدست آمده از طرح حاضر در ژنبانك ثبت خواهد شد.
69380700
دانشگاه علوم پزشكي گلستان
1300147200
0
بلي
خير
فعال و منتشر شده
1309910400